Що означає вираз «активність ферменту»? Метаболізм та ферменти. Відмінність ферментів від неорганічних каталізаторів
Метаболізм- Підтримує сукупність хімічних реакцій організму. Згадавши про мільярди реакцій, що постійно відбуваються, можна здивуватися, як у нас залишаються сили на щось ще. А оскільки одна з головних цілей метаболізму – забезпечення організму готової до використання енергією, дуже важливо, щоб її вироблення перевищувало – і набагато – витрати на виробництво. На щастя, під час еволюції ми отримали молекули, основним завданням яких стало зменшення енерговитрат, необхідні хімічних реакцій в організмі. Їх називають ферментами.
Це великі білкові молекули, присутні у всіх наших клітинах і шляхом серії реакцій перетворюють одне (скажімо, молекулу цукру), що називається субстратом, в інше (наприклад, пов'язана з глюкозою речовина, з якої організм синтезує жири) - продукт або метаболіт. Уявіть собі ферменти як великі автоматизовані фабрики: з одного боку величезної будівлі ви подаєте колоду (субстрат), а на виході отримуєте гарну салатницю (продукт). Звичайно, можна зробити її вручну, але на це піде набагато більше сил та часу; Фабрика сильно підвищує ефективність.
Ферментироблять те ж усередині клітини, швидко перетворюючи субстрати на продукти та споживаючи при цьому дуже мало енергії. Реакції, що вони викликають (біологи використовують слово «каталізують»), рідко чи зовсім відбуваються без допомоги ферментів. Якщо це трапляється, швидкість реакції становить крихітну частку можливої за участю ферменту, а витрати енергії набагато вищі.
Відносні розміри ферментів дуже великі. Їхні молекули можуть бути в 10–20 тис. разів більшими за молекули субстрату, який вони обробляють. І справді схоже на фабрику та поліно. На рис. 7.4 показаний субстрат А, що перетворюється на продукт Б. Однак більшість реакцій не відбувається ізольовано: вони пов'язані з наступними, де Б (тепер уже субстрат) перетворюється на В (новий продукт). Фермент 1 перетворює А на Б, а фермент 2 - Б на В.
Мал. 7.4. Проста ферментативна реакція
Ферменти можуть працювати з різною силою залежно від запасів (кількості субстрату) та потреб (кількості наявного в клітині продукту). Як конвеєр, який рухається швидше або повільніше в залежності від поставки сировини та попиту на готову продукціюферменти змінюють швидкість перетворення субстратів (на професійною мовою- "Активність"). Вони можуть каталізувати навіть зворотні реакції, перетворюючи продукт на субстрат. Загалом, від ферментів залежить, чи відбудеться реакція, а якщо так, то як швидко і в якому напрямі.
Ферментативна активність та форма ферменту
Початкова форма ферментівнагадує ланцюжок амінокислот, розташованих у послідовності, яка закодована в ДНК. Але, оскільки амінокислоти мають хімічну та фізичну спорідненість, ланцюжок складається і утворює тривимірну форму, як дуже довга нитка намагнічених намистин (рис. 7.5).
Мал. 7.5. Комп'ютерна модель ферменту цАДФ-рибози-гідролази (CD38)
Один із способів коригування ферментативної активності - Зміна форми ферменту. Це має серйозні наслідки, тому що змінює його хімічні та фізичні властивостіа також здатність модифікувати швидкість реакції. Багато вчених-ензимологів поетизують швидкість, з якою ферменти змінюють конфігурацію до виконання своїх завдань. Ось показова стаття з New World Encyclopedia (http://www.newworldencyclopedia.org):
Щоб фермент був функціональний, він має набути тривимірної форми. Як відбувається цей складний процес залишається загадкою. Невеликий ланцюжок із 150 амінокислот утворює фермент, що має неймовірну кількість можливих конфігурацій: якщо перевіряти по 1012 різних конфігураційв секунду, знадобиться 1026 років, щоб знайти вірну...
Але фермент, що денатурував, може правильно скластися за частку секунди, а потім брати участь у хімічних реакціях… Це показує приголомшливу складність і гармонію Всесвіту.
Намагаючись описати невимовне, автор наводить приклад порівняно невеликий (для ферменту) гіпотетичної молекули. Швидкість складання ферменту з лінійного ланцюжка у готову до роботи сферу феноменальна. Не менш приголомшує хімічну різноманітність субстратів, які можуть метаболізувати один активний фермент. І так само вражає безліч факторів, здатних модифікувати структуру ферментів, їх кількість і активність.
Все це показує глибоку зв'язок між метаболізмом поживних речовині світом ферментів. Каталізовані ними реакції, нескінченні числом і нескінченно переплетені, контролюються нутрієнтами та зв'язаними сполуками, число яких також нескінченно.
Ферментативна активність мікроорганізмів багата та різноманітна. Нею можна встановити як видову і типову приналежність мікроба, а й визначити його варіанти (так звані біовари). Розглянемо основні ферментативні властивості та його якісне визначення.
Розщеплення вуглеводів(сахаролітична активність), тобто здатність розщеплювати цукру та багатоатомні спирти з утворенням кислоти або кислоти та газу, вивчають на середовищах Гісса, які містять той чи інший вуглевод та індикатор. Під дією кислоти, що утворюється при розщепленні вуглеводу, індикатор змінює забарвлення середовища. Тому ці середовища названі "строкатий ряд". Мікроби, що не ферментують цей вуглевод, ростуть на середовищі, не змінюючи її. Наявність газу встановлюють за утворенням бульбашок у середовищах з агаром або за скупченням його в "поплавці" на рідких середовищах. "Поплавець" - вузька скляна трубочка із запаяним кінцем, зверненим догори, яку до стерилізації поміщають у пробірку із середовищем (рис. 18).
Мал. 18. Вивчення цукролітичної активності мікроорганізмів. I - "строкатий ряд": а - рідке середовище з вуглеводами та індикатором Андреде; б – напіврідке середовище з індикатором ВР: 1 – мікроорганізми не ферментують вуглевод; 2 - мікроорганізми ферментують вуглевод із утворенням кислоти; 3 - мікроорганізми ферментують вуглевод з утворенням кислоти та газу; II - колонії мікроорганізмів, що не розкладають (безбарвні) і розкладають лактозу (фіолетові на середовищі ЕМС - зліва, червоні на середовищі Ендо - праворуч)
Крім того, цукролітичну активність вивчають на середовищах Ендо, ЕМС, Плоскірєва. Мікроорганізми, зброджуючи до кислоти молочний цукор (лактозу), що знаходиться в цих середовищах, утворюють пофарбовані колонії - кислота змінює колір наявного в середовищі індикатора. Колонії мікробів, що не ферментують лактозу, безбарвні (див. рис. 18).
Молоко при зростанні мікробів, що зброджує лактозу, згортається.
При зростанні мікроорганізмів, що утворюють амілазу, на середовищах із розчинним крохмалем відбувається його розщеплення. Про це дізнаються, додавши до культури кілька крапель розчину Люголя – колір середовища не змінюється. Нерозщеплений крохмаль дає із цим розчином синє фарбування.
Протеолітичні властивості(тобто здатність розщеплювати білки, поліпептиди тощо) вивчають на середовищах з желатином, молоком, сироваткою, пептоном. При зростанні на желатиновому середовищі мікробів, що ферментують желатин, середовище розріджується. Характер розрідження, що викликається різними бактеріями, різний (рис. 19). Мікроби, що розщеплюють казеїн (молочний білок), викликають пептонізацію молока - воно набуває вигляду молочної сироватки. При розщепленні пептонів можуть виділятися індол, сірководень, аміак. Їх освіту встановлюють за допомогою індикаторних папірців. Фільтрувальний папір заздалегідь просочують певними розчинами, висушують, нарізають вузькими смужками довжиною 5-6 см і після посіву культури на МПБ поміщають під пробку між нею та стінкою пробірки. Після інкубації у термостаті враховують результат. Аміак викликає посиніння лакмусового папірця; при виділенні сірководню на папірці, просоченому 20% розчином свинцю ацетату та натрію гідрокарбонату, відбувається утворення свинцю сульфату - папірець чорніє; індол викликає почервоніння папірця, просоченого розчином щавлевої кислоти(Див. рис. 19).
Мал. 19. Протеолітичні властивості мікроорганізмів. 1 - форми розрідження желатину; II – визначення сірководню; III – визначення індолу: 1 – негативний результат; 2 – позитивний результат
Крім зазначених середовищ, здатність мікроорганізмів розщеплювати різні поживні субстрати визначають за допомогою паперових дисків, просочених певними реактивами (індикаторні системи паперові "СІБ"). Ці диски опускають у пробірки з досліджуваної культурою і вже через 3 години інкубації в термостаті при 37° З зміни кольору дисків судять про розкладання вуглеводів, амінокислот, білків і т.д.
Гемолітичні властивості (здатність руйнувати еритроцити) вивчають на середовищах із кров'ю. Рідкі середовища у своїй стають прозорими, але в щільних середовищах навколо колонії з'являється прозора зона (рис. 20). При утворенні метгемоглобіну середовище зеленіє.
Мал. 20. Гемоліз навколо колоній, що ростуть на агарі з кров'ю
Збереження культур
Виділені та вивчені культури (штами), що становлять цінність для науки чи виробництва, зберігають у музеях живих культур. Загальносоюзний музей знаходиться у Державному НДІ стандартизації та контролю медичних біологічних препаратів ім. Л. А. Тарасевича (ДІБК).
Завдання зберігання - підтримати життєздатність мікроорганізмів та попередити їх мінливість. Для цього треба послабити або припинити обмін у мікробній клітині.
Один із найдосконаліших методів тривалого збереження культур – ліофілізація – висушування у вакуумі із замороженого стану дозволяє створити стан анабіозу. Висушування проводять у спеціальних апаратах. Зберігають культури в запаяних ампулах при температурі 4°, краще при -30-70°С.
Відновлення висушених культур. Сильно нагрівають кінчик ампули в полум'ї пальника і торкаються нього ватним тампоном, злегка змоченим. холодною водоющоб на склі утворилися мікротріщини, через які повітря повільно просочиться всередину ампули. При цьому, проходячи через розігріті краї тріщин повітря стерилізується.
* (При надлишку води на тампоні вона може потрапити в ампулу і порушити стерильність культури: її засмоктить через мікротріщини, що утворилися, так як в ампулі вакуум.)
Увага! Не забувайте, що у запаяній ампулі вакуум. Якщо повітря в неї потрапляє відразу через великий отвір, може розпорошитися культура, що знаходиться в ампулі, і відбутися її викид.
Давши увійти в повітря, швидко пінцетом надламують і видаляють верхівку ампули. Злегка обпікають отвір і пастерівською стерильною піпеткою або шприцом вносять в ампулу розчинник (бульйон або ізотонічний розчин). Перемішують вміст ампули і засівають на середовищі. Зростання відновлених культур у перших посівах може бути сповільнене.
Довго зберігати культури можна також у рідкому азоті (-196 ° С) у спеціальних приладах.
Методи нетривалого збереження культур такі: 1) субкультивування (періодичні пересіви на свіжі середовища) з інтервалами, що залежать від властивостей мікроорганізму, середовища та умов культивування. Між пересіваннями культури зберігають при 4°; 2) збереження під шаром олії. Культуру вирощують в агарі стовпчиком заввишки 5-6 см, заливають стерильною вазеліновою олією (шар олії приблизно 2 см) і зберігають вертикально в холодильнику. Терміни зберігання різних мікроорганізмів різні, тому з пробірок періодично висівають культуру, щоб перевірити її життєздатність; 3) зберігання при -20-70 ° С; 4) зберігання у запаяних пробірках. При необхідності зберігається матеріал висівають на свіже середовище.
1. Що входить у поняття "бактеріологічне дослідження"?
2. Якою має бути культура для такого дослідження?
3. Що таке колонія бактерій, культура, штам, клон?
4. Що входить у поняття "культуральні властивості мікробів"?
Завдання
1. Вивчіть та опишіть кілька колоній. Пересійте їх на скошений агар і сектор.
2. Вивчіть та опишіть характер зростання – культури на скошеному агарі. Визначте чистоту та морфологію культури у забарвленому препараті.
3. Пересійте культуру зі скошеного агару на бульйон та на диференціально-діагностичні середовища. Вивчіть та запишіть у протокол характер зростання культури на цих середовищах та її ферментативні властивості.
Ферменти – це каталізатори хімічних реакцій білкової природи, що відрізняються специфічністю дії щодо каталізу певних хімічних реакцій. Вони є продуктами біосинтезу всіх живих ґрунтових організмів: деревних та трав'янистих рослин, мохів, лишайників, водоростей, мікроорганізмів, найпростіших, комах, безхребетних та хребетних тварин, представлених у природній обстановці певними сукупностями – біоценозами.
Біосинтез ферментів у живих організмах здійснюється завдяки генетичним факторам, відповідальним за спадкову передачу типу обміну речовин та його пристосувальну мінливість. Ферменти є робочим апаратом, з якого реалізується дію генів. Вони каталізують в організмах тисячі хімічних реакцій, у тому числі складається клітинний обмін. Завдяки їм хімічні реакції в організмі здійснюються з швидкістю.
Нині відомо понад 900 ферментів. Їх поділяють на шість основних класів.
1. Оксиредуктази, що каталізують окисно-відновні реакції.
2. Трансферази, що каталізують реакції міжмолекулярного перенесення різних хімічних груп та залишків.
3. Гідролази, що каталізують реакції гідролітичного розщеплення внутрішньомолекулярних зв'язків.
4. Ліази, що каталізують реакції приєднання груп з подвійних зв'язків та зворотні реакції відриву таких груп.
5. Ізомерази, що каталізують реакції ізомеризації.
6. Лігази, що каталізують хімічні реакції з утворенням зв'язків за рахунок АТФ (аденозинтрифосфорної кислоти).
При відмиранні та перегниванні живих організмів частина їх ферментів руйнується, а частина, потрапляючи у ґрунт, зберігає свою активність і каталізує багато ґрунтових хімічних реакцій, беручи участь у процесах ґрунтоутворення та у формуванні якісної ознаки ґрунтів – родючості. У різних типахґрунтів під певними біоценозами сформувалися свої ферментативні комплекси, що відрізняються активністю біокаталітичних реакцій.
В. Ф. Купревич і Т. А. Щербакова (1966) відзначають, що важливою рисою ферментативних комплексів ґрунтів є впорядкованість дії наявних груп ферментів, яка проявляється в тому, що забезпечується одночасна дія ряду ферментів, що представляють різні групи; виключаються утворення та накопичення сполук, що є у ґрунті в надлишку; надлишки накопичених рухомих простих з'єднань(наприклад, NH 3) тим чи іншим шляхом тимчасово зв'язуються і направляються в цикли, що завершуються утворенням більш менш складних сполук. Ферментативні комплекси є врівноваженими саморегулюючими системами. У цьому основну роль відіграють мікроорганізми та рослини, що постійно поповнюють ґрунтові ферменти, оскільки багато з них є короткоживучими. Про кількість ферментів побічно судять з їхньої активності в часі, яка залежить від хімічної природиреагуючих речовин (субстрату, ферменту) та умов взаємодії (концентрації компонентів, рН, температури, складу середовища, дії активаторів, інгібіторів тощо).
У цьому розділі розглядається участь у деяких хімічних ґрунтових процесах ферментів з класу гідролаз - активність інвертази, уреази, фосфатази, протеази та з класу оксиредуктаз - активність каталази, пероксидази та поліфенолоксидази, що мають велике значенняу перетворенні азот- і фосфоровмісних органічних речовин, речовин вуглеводного характеру та у процесах утворення гумусу. Активність цих ферментів – суттєвий показник родючості ґрунтів. Крім того, буде охарактеризовано активність цих ферментів у лісових та орних ґрунтах різного ступеня окультуреності на прикладі дерново-підзолистих, сірих лісових та дерново-карбонатних ґрунтів.
ХАРАКТЕРИСТИКА ҐРУННИХ ФЕРМЕНТІВ
Інвертаза – каталізує реакції гідролітичного розщеплення сахарози на еквімолярні кількості глюкози та фруктози, впливає також на інші вуглеводи з утворенням молекул фруктози – енергетичного продукту для життєдіяльності мікроорганізмів, каталізує фруктозотрансферазні реакції. Дослідження багатьох авторів показали, що активність інвертази краще за інші ферменти відображає рівень родючості та біологічної активності ґрунтів.
Уреаза-каталізує реакції гідролітичного розщеплення сечовини на аміак та діоксид вуглецю. У зв'язку з використанням сечовини в агрономічній практиці необхідно мати на увазі, що активність уреази вище у більш родючих ґрунтів. Вона підвищується у всіх ґрунтах у періоди їх найбільшої біологічної активності – у липні – серпні.
Фосфатаза (лужна та кисла) - каталізує гідроліз низки фосфорорганічних сполук з утворенням ортофосфату. Активність фосфатази знаходиться у зворотній залежності від забезпеченості рослин рухомим фосфором, тому вона може бути використана як додатковий показник при встановленні потреби внесення до ґрунту фосфорних добрив. Найбільш висока фосфатазна активність у ризосфері рослин.
Протеази - це група ферментів, за участю яких білки розщеплюються до поліпептидів та амінокислот, далі вони піддаються гідролізу до аміаку, діоксиду вуглецю та води. У зв'язку з цим протеази мають найважливіше значення у житті грунту, оскільки із нею пов'язані зміна складу органічних компонентів і динаміка засвоюваних рослин азоту.
Каталаза – в результаті її активуючої дії відбувається розщеплення перекису водню, токсичного для живих організмів, на воду та вільний кисень. Великий впливна каталазну активність мінеральних ґрунтів надає рослинність. Як правило, грунти, що знаходяться під рослинами з потужною кореневою системою, що глибоко проникає, характеризуються високою каталазною активністю. Особливість активності каталази полягає в тому, що вниз по профілю вона мало змінюється, має зворотну залежність від вологості ґрунтів та пряму – від температури.
Поліфенолоксидаза і пероксидаза - їм у ґрунтах належить важлива роль у процесах гумусутворення. Поліфенолоксидаза каталізує окислення поліфенолів у хінони у присутності вільного кисню повітря. Пероксидаза каталізує окислення поліфенолів у присутності перекису водню або органічних перекисів. При цьому її роль полягає в активуванні перекисів, оскільки вони мають слабку окислювальну дію на феноли. Далі може відбуватися конденсація хінонів з амінокислотами та пептидами з утворенням первинної молекули гумінової кислоти, яка надалі здатна ускладнюватися за рахунок повторних конденсацій (Кононова, 1963).
Помічено (Чундерова, 1970), що відношення активності поліфенолоксидази (S) до активності пероксидази (D), виражене у відсотках (), має зв'язок із накопиченням у ґрунтах гумусу, тому ця величина отримала назву умовний коефіцієнт накопичення гумусу (К). У орних слабоокультурених ґрунтів Удмуртії за період з травня по вересень він становив: у дерново-підзолистого – 24 %, у сірого лісового опідзоленого – 26 і у дерново-карбонатного ґрунту – 29 %.
ФЕРМЕНТАТИВНІ ПРОЦЕСИ У ҐРУНТАХ
Біокаталітична активність ґрунтів знаходиться у значній відповідності зі ступенем збагаченості їх мікроорганізмами (табл. 11), залежить від типу ґрунтів та змінюється за генетичними горизонтами, що пов'язано з особливостями зміни вмісту гумусу, реакції, Red-Ox-потенціалу та інших показників за профілем.
У цілинних лісових грунтах інтенсивність ферментативних реакцій переважно визначають горизонти лісової підстилки, а орних - орні верстви. Як в одних, так і в інших ґрунтах всі біологічно менш активні генетичні горизонти, що знаходяться під горизонтами А або А п, мають низьку активність ферментів, що незначно змінюється в позитивний бікпри окультуренні ґрунтів. Після освоєння лісових ґрунтів під ріллю ферментативна активність утвореного орного горизонту в порівнянні з лісовою підстилкою виявляється різко зниженою, але в міру його окультурення підвищується і в сильно окультурених видах наближається або перевищує показники лісової підстилки.
11. Зіставлення біогенносгу та ферментативної активності ґрунтів Середнього Передуралля (Пухідська, Ковриго, 1974)
|
№ розрізу, назва ґрунту |
Горизонт, глибина взяття зразка, см |
Загальна кількість мікроорганізмів, тис. на 1 г абс. сухий. ґрунту (в середньому за 1962, 1964-1965 рр.) |
Показники активності ферментів (загалом за 1969-1971 рр.) |
|||||||
|
Інвертаза, мг глюкози на 1 г ґрунту за I добу |
Фосфатаза, мг фенолфталеїну на 100 г ґрунту за 1 год |
Уреаза, мг NH, на 1 г ґрунту за 1 добу |
Каталаза, мл 0 2 на 1 г ґрунту за 1 хв |
Поліфенолоксидаза |
Пероксидаза |
|||||
|
мг пурпурогалліну на 100 г ґрунту |
||||||||||
|
3. Дерново-середньопідзолиста середньосуглиниста (під лісом) |
||||||||||
|
Не визначали |
||||||||||
|
1.Дерново-середньо-підзолиста середньо-суглиниста слабоокультурена |
||||||||||
|
10. Сіраялісна опідзолена важко осуглиниста слабоокультурена |
||||||||||
|
2. Дерново-карбонатна слабовищело-чена л егкосуглиниста слабоокультурена |
||||||||||
Активність біокаталітичних реакцій ґрунтів змінюється. Найменша вона навесні та восени, а найвища зазвичай у липні-серпні, що відповідає динаміці загального ходу біологічних процесіву ґрунтах. Однак залежно від типу ґрунтів та їх географічне положеннядинаміка ферментативних процесів дуже різна.
Контрольні питання та завдання
1. Які сполуки називають ферментами? Які їх продукування та значення для живих організмів? 2. Назвіть джерела ґрунтових ферментів. Яку роль грають окремі ферменти у ґрунтових хімічних процесах? 3. Дайте поняття про ферментативний комплекс грунтів та його функціонування. 4. Дайте загальну характеристикутечії ферментативних процесів у цілинних та орних ґрунтах.
1. Особливості ферментативних реакцій
2. Вплив температури на активність ферментів
3. Вплив рН на активність ферментів
4. Активатори та інгібітори ферментів
I. Усі ферментативні реакції мають 4 особливості
· Висока активність ферментів;
· Оборотність дії ферментів;
· Специфіка дії ферментів;
· Лабільність (чутливість).
Висока активність ферментів.Ферменти зумовлюють високу швидкість ферментативної реакції, що характеризується числом оборотів ферментів – це кількість молекул субстрату, що перетворюється на продукти реакції при дії однієї молекули ферменту за одиницю часу. Наприклад, алкогольдегідрогеназа має активність 4700 од., фосфорилаза – 50000 од., a-амілаза – 16000 од.
Оборотність дії ферментіввстановив Данилевський. Під оборотністю впливу ферментів розуміють освіту комплексу ES та її розпад, тобто. реакції за участю ферменту можуть йти як в один бік (біосинтез), так і у зворотний (розпад).
Специфіка дії ферментів- кожен фермент діє лише на свій певний субстрат чи групу родинних субстратів. Наприклад, інвертаза діє сахарозу; a-амілаза – тільки на крохмаль та декстрини; протеази – на білки.
Існує дві точки зору, що пояснюють специфічність дії ферментів. За образним уявленням Еге. Фішера “фермент підходить до субстрату як ключі до замку”, тобто. топографія активного центру ферменту як високоупорядкована, а й жорстко закріплена. Активний центр ферменту відповідає топографії лише одного єдиного субстрату. Друга думка, запропонована Д. Кошландом - теорія індукованого відповідності ферменту та субстрату: конформація ферменту, особливо його активного центру, здатна до певних модифікацій. Залежно від конформаційної рухливості активного центру фермент здатний взаємодіяти або з небагатьма, або з різними субстратами. Іншими словами, в момент утворення комплексу ЕS відбуваються зміни в структурі як ферменту, так і субстрату. Внаслідок чого вони адаптуються один до одного.
Специфіка ферментів грає важливу рольу процесі обміну речовин у живому організмі. (Якби фермент не мав унікальних властивостей, то в живому організмі не було б обміну речовин)
За ознакою специфічності ферменти поділяються на 2 групи:
· Абсолютна специфічність - фермент діє тільки на одну-єдину речовину або каталізує тільки певне перетворення цієї речовини;
· Відносна або групова специфічність - ферменти діють відразу на багато субстратів, що мають ряд загальних структурних властивостей.
Лабільність (чутливість) -всі ферменти чутливі до підвищення температури та низьких значень рН, у яких відбувається втрата активності ферментів.
II. Найважливішим факторомвід якого залежить активність ферментів, є температура.
Графічно залежність швидкості ферментативної реакції від температури виглядає так:
При 0°С, а тим більше при температурах нижче 0°С, дія більшості ферментів припиняється. Підвищення температури (крива 1) вище 0°С сприяє збільшенню активності ферментів (збільшується кількість зіткнень речовин, що реагують). При певній температуріфермент виявляє максимальну активність. Для більшості ферментів оптимальною температуроюдії 40-50°С. Подальше підвищення температури призводить до інактивації ферментів (зменшення активності) внаслідок термічної денатурації білкової молекули (крива 2).
Зміна швидкості реакції при підвищенні температури на кожні 10°З виражають температурним коефіцієнтом Q 10 . Температурний коефіцієнтявляє собою відношення швидкість реакції при даній температурі v t +10 швидкості реакції при температурі на 10°С нижче даної:
Величина Q 10 для хімічних реакцій лежить у межах 2-4, для ферментативної реакції - між 1 і 2; Q 10 ферментативних реакцій помітно знижується при підвищенні температури.
III. Кожен фермент виявляє свою дію в межах досить тонкої зони рН. Графічна залежність активності ферменту від рН має вигляд:
У кислому середовищі, при низьких значеннях рН, має форму ЕН 2+, у такій формі він малоактивний. При оптимумі рН фермент має максимальну активність і знаходиться у формі ЕН; при підлужуванні середовища, фермент набуває форми Е - .
Оптимальній активності відповідає певна область рН, причому кожен фермент має своє оптимальне значення рН дії (наприклад, бактеріальна a-амілаза має рН оптимум при 6, а a-амілаза мікроскопічних грибів - 4,7). Оптимальне значеннярН пов'язано з амінокислотним складом ферментів.
Дзвоноподібна форма кривої порозуміється з амфотерною природою ферментів; висхідна та низхідна гілки цієї кривої є типовими кривими титрування та визначається значеннями рК іонних груп, які знаходяться в активному центрі ферментів.
Для визначення функціональних груп, що входять до активного центру ферменту, необхідно визначити залежності активності цього ферменту від рН за різних температур і визначити значення рК. Знаючи значення ΔрК для кислої та лужної гілки залежності v = f(pH) знаходять функціональні групи, які відповідають цьому значенню.
IV. Всі речовини, що супроводжують фермент у процесі реакції, можна підрозділити на активатори, інгібітори та нейтральні сполуки.
Активатори– хімічні сполуки, що підвищують дію ферментів (наприклад, глютатіон активізує дію протеаз, NaCl збільшує активність амілаз); інгібітори– сполуки, що пригнічують їхню активність (наприклад, група –CN пригнічує активність дихальних ферментів, що знаходяться в цитохромній системі) та нейтральні сполукине впливають на ферменти.
Процес інгібування може бути оборотнимі незворотнім.
Зворотні інгібітори бувають:
· Конкурентної дії – інгібітор взаємодіє з функціональними групами активного центру ферментів. Інгібування в даному випадкузалежить від концентрації субстрату: якщо [S] велика, вплив інгібітору [I] може виявлятися; якщо ж [S] мала, то інгібітор може витіснити субстрат із сполуки з ферментом, дія якого при цьому загальмовується. Потрійний комплекс ЕSI при конкурентному інгібуванні ніколи не утворюється.
· Безконкурентне інгібування спостерігається в тому випадку, коли інгібітор не здатний приєднуватися до ферменту, не може зв'язуватися з фермент-субстратним комплексом, переводячи його в неактивну форму.
· При змішаному пригніченні інгібітор діє як на ділянку зв'язування ES, так і на каталітичний центр ферменту.
(Активатори - підвищують, інгібітори - знижують) Білкові ферменти синтезуються на рибосомах, а РНК - в ядрі.
Терміни «фермент» та «ензим» давно використовують як синоніми (перший в основному в російській та німецькій науковій літературі, другий - в англо- та франкомовній).
Наука про ферменти називається ензимологією, а не ферментологією (щоб не змішувати коріння слів латинської та грецької мов).
Історія вивчення
Термін ферментзапропонований у XVII столітті хіміком ван Гельмонтом під час обговорення механізмів травлення.
У кін. ХVІІІ – поч. ХІХ ст. вже було відомо, що м'ясо перетравлюється шлунковим соком, а крохмаль перетворюється на цукор під дією слини. Однак механізм цих явищ був невідомий
Ферменти широко використовуються в народному господарстві- харчовий, текстильної промисловостіу фармакології.
Класифікація ферментів
За типом каталізованих реакцій ферменти поділяються на 6 класів згідно з ієрархічною класифікацією ферментів (КФ - Enzyme Comission code). Класифікацію було запропоновано Міжнародним союзом біохімії та молекулярної біології (International Union of Biochemistry and Molecular Biology). Кожен клас містить підкласи, тому фермент описується сукупністю чотирьох чисел, розділених точками. Наприклад, пепсин має назву ЄС 3.4.23.1. Перше число грубо описує механізм реакції, що каталізується ферментом:
- КФ 1: Оксидоредуктази, що каталізують окиснення або відновлення. Приклад: каталаза, алкогольдегідрогеназа
- КФ 2: Трансферази, що каталізують перенесення хімічних груп з однієї молекули субстрату на іншу Серед трансфераз особливо виділяють кінази, що переносять фосфатну групу, як правило, з молекули АТФ.
- КФ 3: Гідролази, що каталізують гідроліз хімічних зв'язків. Приклад: естерази, пепсин, трипсин, амілаза, ліпопротеїнліпаза
- КФ 4: Ліазикаталізують розрив хімічних зв'язків без гідролізу з утворенням подвійного зв'язку в одному з продуктів.
- КФ 5: Ізомерази, що каталізують структурні або геометричні зміни в молекулі субстрату
- КФ 6: Лігази, що каталізують утворення хімічних зв'язків між субстратами за рахунок гідролізу АТФ Приклад: ДНК-полімераза
Кінетичні дослідження
Крива насичення хімічної реакції, що ілюструє співвідношення між концентрацією субстрату [S] та швидкістю реакції v
Найпростішим описом кінетики односубстратних ферментативних реакцій є рівняння Міхаеліса – Ментен (див. рис.). Сьогодні описано кілька механізмів дії ферментів. Наприклад, дія багатьох ферментів описується схемою механізму пінг-понг.
Структура та механізм дії ферментів
Активність ферментів визначається їхньою тривимірною структурою.
Як і всі білки, ферменти синтезуються у вигляді лінійного ланцюжка амінокислот, яка згортається певним чином. Кожна послідовність амінокислот згортається особливим чином, і виходить молекула (білкова глобула) має унікальними властивостями. Декілька білкових ланцюгів можуть об'єднуватися в білковий комплекс. Третинна структура білків руйнується при нагріванні чи дії деяких хімічних речовин.
Щоб каталізувати реакцію, фермент має зв'язатися з одним чи кількома субстратами. Білковий ланцюг ферменту згортається таким чином, що на поверхні глобули утворюється щілина або западина, де зв'язуються субстрати. Ця область називається сайтом зв'язування субстрату. Зазвичай він збігається з активним центром ферменту або знаходиться поблизу нього. Деякі ферменти містять сайти зв'язування кофакторів або іонів металів.
У деяких ферментів є сайти зв'язування малих молекул, вони можуть бути субстратами або продуктами метаболічного шляху, до якого входить фермент. Вони зменшують або збільшують активність ферменту, що створює можливість зворотного зв'язку.
Для активних центрів деяких ферментів характерне явище кооперативності.
Специфіка
Ферменти зазвичай виявляють високу специфічність стосовно своїх субстратів. Це досягається частковою комплементарністю форми, розподілу зарядів та гідрофобних областей на молекулі субстрату та у центрі зв'язування субстрату на ферменті. Ферменти демонструють високий рівеньстереоспецифічності, регіоселективності та хемоселективності.
Модель «ключ-замок»
Гіпотеза Кошланда про індуковану відповідність
Більш реалістична ситуація у разі індукованої відповідності. Неправильні субстрати – надто великі чи надто маленькі – не підходять до активного центру
У 1890 р. Еміль Фішер припустив, що специфічність ферментів визначається точною відповідністю форми ферменту та субстрату. Таке припущення називається моделлю "ключ-замок". Фермент з'єднується з субстратом з утворенням короткоживучого фермент-субстратного комплексу. Проте, хоча ця модель пояснює високу специфічність ферментів, вона пояснює явища стабілізації перехідного стану, що спостерігається практично.
Модель індукованої відповідності
У 1958 р. Деніел Кошланд запропонував модифікацію моделі «ключ-замок». Ферменти, переважно, - не жорсткі, а гнучкі молекули. Активний центр ферменту може змінити конформацію після зв'язування субстату. Бічні групи амінокислот активного центру приймають таке положення, що дозволяє ферменту виконати свою функцію каталітичну. У деяких випадках молекула субстрату змінює конформацію після зв'язування в активному центрі. На відміну від моделі «ключ-замок», модель індукованої відповідності пояснює як специфічність ферментів, а й стабілізацію перехідного стану.
Модифікації
Багато ферментів після синтезу білкового ланцюга зазнають модифікації, без яких фермент не виявляє своєї активності повною мірою. Такі модифікації називаються посттрансляційними модифікаціями (процесингом). Один із найпоширеніших типів модифікації - приєднання хімічних груп до бічних залишків поліпептидного ланцюга. Наприклад, приєднання залишку фосфорної кислоти називається фосфорилюванням, воно каталізується ферментом кіназою. Багато ферментів еукаріотів глікозильовані, тобто модифіковані олігомерами вуглеводної природи.
Ще один поширений тип посттранляційних модифікацій – розщеплення поліпептидного ланцюга. Наприклад, хімотрипсин (протеаза, що бере участь у травленні), виходить при вищепленні поліпептидної ділянки з хімотрипсиногену. Хімотрипсиноген є неактивним попередником хімотрипсину і синтезується в підшлунковій залозі. Неактивна форма транспортується на шлунок, де перетворюється на хімотрипсин. Такий механізм необхідний для того, щоб уникнути розщеплення підшлункової залози та інших тканин до надходження ферменту до шлунка. Неактивний попередник ферменту називають також "зимогеном".
Кофактори ферментів
Деякі ферменти виконують каталітичну функцію власними силами, без будь-яких додаткових компонентів. Однак є ферменти, яким для здійснення каталізу необхідні компоненти небілкової природи. Кофактори можуть бути як неорганічними молекулами (іони металів, залізо-сірчані кластери та ін), так і органічними (наприклад,
