Ферментативна активність мікробів. Вимірювання ферментативної активності. Основи кількісного визначення активності ферментів

Метаболізм- сукупність, що підтримує життя хімічних реакційорганізму. Згадавши про мільярди реакцій, що постійно відбуваються, можна здивуватися, як у нас залишаються сили на щось ще. А оскільки одна з головних цілей метаболізму – забезпечення організму готової до використання енергією, дуже важливо, щоб її вироблення перевищувало – і набагато – витрати на виробництво. На щастя, під час еволюції ми отримали молекули, основним завданням яких стало зменшення енерговитрат, необхідні хімічних реакцій в організмі. Їх називають ферментами.

Це великі білкові молекули, присутні у всіх наших клітинах і шляхом серії реакцій перетворюють одне (скажімо, молекулу цукру), що називається субстратом, в інше (наприклад, пов'язана з глюкозою речовина, з якої організм синтезує жири) - продукт або метаболіт. Уявіть собі ферменти як великі автоматизовані фабрики: з одного боку величезної будівлі ви подаєте колоду (субстрат), а на виході отримуєте гарну салатницю (продукт). Звичайно, можна зробити її вручну, але на це піде набагато більше сил та часу; Фабрика сильно підвищує ефективність.

Ферментироблять те ж усередині клітини, швидко перетворюючи субстрати на продукти та споживаючи при цьому дуже мало енергії. Реакції, що вони викликають (біологи використовують слово «каталізують»), рідко чи зовсім відбуваються без допомоги ферментів. Якщо це трапляється, швидкість реакції становить крихітну частку можливої ​​за участю ферменту, а витрати енергії набагато вищі.

Відносні розміри ферментів дуже великі. Їхні молекули можуть бути в 10–20 тис. разів більшими за молекули субстрату, який вони обробляють. І справді схоже на фабрику та поліно. На рис. 7.4 показаний субстрат А, що перетворюється на продукт Б. Однак більшість реакцій не відбувається ізольовано: вони пов'язані з наступними, де Б (тепер уже субстрат) перетворюється на В (новий продукт). Фермент 1 перетворює А на Б, а фермент 2 - Б на В.

Мал. 7.4. Проста ферментативна реакція

Ферменти можуть працювати з різною силою залежно від запасів (кількості субстрату) та потреб (кількості наявного в клітині продукту). Як конвеєр, який рухається швидше або повільніше в залежності від поставки сировини та попиту на готову продукціюферменти змінюють швидкість перетворення субстратів (на професійною мовою- "Активність"). Вони можуть каталізувати навіть зворотні реакції, перетворюючи продукт на субстрат. Загалом, від ферментів залежить, чи відбудеться реакція, а якщо так, то як швидко і в якому напрямі.

Ферментативна активність та форма ферменту

Початкова форма ферментівнагадує ланцюжок амінокислот, розташованих у послідовності, яка закодована в ДНК. Але, оскільки амінокислоти мають хімічну та фізичну спорідненість, ланцюжок складається і утворює тривимірну форму, як дуже довга нитка намагнічених намистин (рис. 7.5).

Мал. 7.5. Комп'ютерна модель ферменту цАДФ-рибози-гідролази (CD38)

Один із способів коригування ферментативної активності- Зміна форми ферменту. Це має серйозні наслідки, тому що змінює його хімічні та Фізичні властивостіа також здатність модифікувати швидкість реакції. Багато вчених-ензимологів поетизують швидкість, з якою ферменти змінюють конфігурацію до виконання своїх завдань. Ось показова стаття з New World Encyclopedia (http://www.newworldencyclopedia.org):

Щоб фермент був функціональний, він має набути тривимірної форми. Як відбувається цей складний процес залишається загадкою. Невеликий ланцюжок із 150 амінокислот утворює фермент, що має неймовірну кількість можливих конфігурацій: якщо перевіряти по 1012 різних конфігураційв секунду, знадобиться 1026 років, щоб знайти вірну...

Але фермент, що денатурував, може правильно скластися за частку секунди, а потім брати участь у хімічних реакціях… Це показує приголомшливу складність і гармонію Всесвіту.

Намагаючись описати невимовне, автор наводить приклад порівняно невеликий (для ферменту) гіпотетичної молекули. Швидкість складання ферменту з лінійного ланцюжка у готову до роботи сферу феноменальна. Не менш приголомшує хімічну різноманітність субстратів, які можуть метаболізувати один активний фермент. І так само вражає безліч факторів, здатних модифікувати структуру ферментів, їх кількість і активність.

Все це показує глибоку зв'язок між метаболізмом поживних речовин та світом ферментів. Каталізовані ними реакції, нескінченні числом і нескінченно переплетені, контролюються нутрієнтами та зв'язаними сполуками, число яких також нескінченно.

Перш ніж обговорювати властивості ферментів та залежність ферментів від будь-яких факторів необхідно визначитися з поняттям активність ферментів.

У повсякденній біохімічній практиці практично не оцінюється кількістьферменту, а лише його активність. Активність – ширше поняття, аніж кількість. Вона має на увазі в першу чергу результат реакції, а саме спад субстратуабо накопиченняпродукту.Звичайно, при цьому не можна ігнорувати час, яке пропрацював фермент і число молекулферменту. Але оскільки число молекул ферменту підрахувати зазвичай неможливо, то застосовують кількістьбіологічного матеріалу, що містить фермент (обсяг чи масу).

Таким чином, при визначенні активності ферментів потрібно одночасно враховувати три змінні:

• масаотриманого продукту або зниклого субстрату,
• час, витрачене на реакцію,
• кількість ферменту, але насправді масу чи обсяг біологічного матеріалу, що містить фермент.

Для розуміння співвідношень зазначених факторів наочним і простим прикладомможе бути будівництво двох будинків. Будинкиприрівняємо до продукту реакції, робітники- Це ферменти, бригаданехай відповідає обсягу біологічного матеріалу. Отже, завдання із 3-го класу:

1. На спорудженні однієї будівлі працювала бригада з 10 осіб, іншої такої самої будівлі – бригада з 5 осіб. Будівництво закінчено одночасно і в повному обсязі. Де вища активність робітників?

2. На спорудженні однієї будівлі з 3 поверхів працювала бригада з 10 осіб, іншої будівлі з 12 поверхів – бригада також із 10 осіб. Будівництво закінчено одночасно та в повному обсязі. Де вища активність робітників?

3. На будівництві однієї будівлі з 5 поверхів працювала бригада з 10 осіб, іншої такої самої будівлі – бригада теж з 10 осіб. Будівництво першої будівлі зайняло 20 днів, друга збудована за 10 днів. Де вища активність робітників?

Основи кількісного визначення активності ферментів

1. Активність ферментувиражається в швидкостінакопичення продукту або швидкості втрат субстрату в перерахунку на кількість матеріалу, що містить фермент.

У практиці зазвичай використовують:

• одиниці кількості речовини – моль (та її похідні ммоль, мкмоль), грам (кг, мг),
• одиниці часу – хвилина, година, секунда,
• одиниці маси чи обсягу – грам (кг, мг), літр (мл).

Активно використовуються інші похідні – катал (моль/с), міжнародна одиниця активності (МЕ, Unit) відповідає мкмоль/хв.

Таким чином, активність ферменту може виражатися, наприклад, ммоль/с×л, г/час×л, МО/л, кат/мл і т.д.

Наприклад, відомо,

• що 1 г пепсинурозщеплює 50 кг яєчного білказа одну годину - таким чином, його активність складе 50 кг/год на 1 г ферменту,
• якщо 1,6 мл слини розщеплює 175 кг крохмалю на годину – активність амілази слинискладе 109,4 кг крохмалю на годину на 1 мл слини або 1,82 кг/хв×г або 30,3 г крохмалю/мл.

2. Створення стандартних умовщоб можна було порівнювати результати, отримані в різних лабораторіях - оптимальна рН і фіксована температура, наприклад, 25°С або 37°С, дотримання часу інкубації субстрату з ферментом.

Ферментативна активністьґрунтів [від лат. Fermentum - закваска] -здатність грунту проявляти каталітичний вплив на процеси перетворення екзогенних та власних органічних та мінеральних сполук завдяки наявним у ньому ферментам. Характеризуючи ферментативну активність ґрунтів, мають на увазі сумарний показник активності. Ферментативна активність різних ґрунтівнеоднакова і пов'язана з їх генетичними особливостями та комплексом взаємодіючих екологічних факторів. Рівень ферментативної активності ґрунтів визначається активністю різних ферментів (інвертази, протеаз, уреази, дегідрогеназ, каталази, фосфатаз), що виражається кількістю розкладеного субстрату за одиницю часу на 1 г ґрунту.

Біокаталітична активність ґрунтів залежить від ступеня збагаченості їх мікроорганізмами та від типу ґрунтів. Активність ферментів змінюється за генетичними горизонтами, які відрізняються за вмістом гумусу, типами реакцій, окислювально-відновним потенціалом та іншими показниками за профілем.

У цілинних лісових грунтах інтенсивність ферментативних реакцій переважно визначають горизонти лісової підстилки, а орних - орні верстви. Усі біологічно менш активні генетичні горизонти, які перебувають під горизонтами А чи Ап, мають низьку активність ферментів. Активність їх трохи зростає при окультуренні грунтів. Після освоєння лісових ґрунтів під ріллю ферментативна активність утвореного орного горизонту в порівнянні з лісовою підстилкою різко знижується, але в міру його окультурення підвищується і в сильно окультурених ґрунтах наближається або перевищує показники лісової підстилки.

Ферментативна активність відображає стан родючості ґрунтів та внутрішні зміни, що відбуваються при сільськогосподарському використанні та підвищенні рівня культури землеробства. Ці зміни виявляються як при залученні цілинних та лісових ґрунтів у культуру, так і при різних прийомах їх використання.

По всій Білорусі в орних ґрунтах щорічно втрачається до 0,9 т/га гумусу. Внаслідок ерозії щорічно безповоротно виноситься з полів 0,57 т/га гумусу. Причинами дегуміфікації ґрунтів є посилення мінералізації ґрунтової органічної речовини, відставання процесів новоутворення гумусу від мінералізації у зв'язку з недостатнім надходженням у ґрунт. органічних добривта зниження ферментативної активності ґрунту.

Біохімічні перетворення органічної речовини ґрунту відбуваються внаслідок мікробіологічної діяльності під впливом ферментів. ферментативна активність грунт мікроорганізм

Особливу роль відіграють ферменти у життєдіяльності тварин, рослин та мікроорганізмів. Ґрунтові ферменти беруть участь при розпаді рослинних, тваринних та мікробних залишків, а також синтезі гумусу. В результаті поживні речовиниіз важко засвоюваних сполук переходять у легко доступні форми для рослин та мікроорганізмів. Ферменти відрізняються високою активністю, суворою специфічністю дії та великою залежністю від різних умовдовкілля. Завдяки каталітичній функції вони забезпечують швидке протікання в організмі або поза його великою кількістю хімічних реакцій.

Разом з іншими критеріями ферментативна активність грунтів може бути надійним діагностичним показником з'ясування ступеня окультуренности грунтів. В результаті досліджень 4, с. 91 встановлено залежність між активністю мікробіологічних та ферментативних процесів та проведенням заходів, що підвищують родючість ґрунтів. Обробка ґрунтів, внесення добрив суттєво змінюють екологічну обстановку розвитку мікроорганізмів.

Нині у біологічних об'єктах виявлено кілька тисяч індивідуальних ферментів, а кілька сотень їх виділено і вивчено. Відомо, що жива клітина може містити до 1000 різних ферментів, кожен із яких прискорює ту чи іншу хімічну реакцію.

Інтерес до застосування ферментів викликаний ще й тим, що постійно зростають вимоги щодо підвищення безпеки технологічних процесів. Присутня у всіх біологічних системах, будучи одночасно продуктами та інструментами цих систем, ферменти синтезуються та функціонують за фізіологічних умов (pH, температура, тиск, присутність неорганічних іонів), після чого легко виводяться, піддаючись руйнуванню до амінокислот. Як продукти, так і відходи більшості процесів, що протікають за участю ферментів, є нетоксичними та легко руйнуються. Крім того, у багатьох випадках, ферменти, що використовуються в промисловості, отримують екологічно безпечним шляхом. Від небіологічних каталізаторів ферменти відрізняють не тільки безпеку та підвищену здатність до біодеградації, але й специфічність дії, м'які умовипротікання реакцій та висока ефективність. Ефективність та специфічність дії ферментів дозволяє отримувати цільові продукти з високим виходом, що робить використання ферментів у промисловості економічно вигідним. Застосування ферментів сприяє скороченню витрати води та енергії в технологічних процесах, зменшує викиди в атмосферу CO2, знижує ризик забруднення довкілляпобічними продуктами технологічних циклів.

Застосуванням передової агротехніки можна змінювати у сприятливий бік мікробіологічні процесине тільки орного, а й підорного шарів ґрунту.

За безпосередньої участі позаклітинних ферментів відбувається розкладання органічних сполукґрунти. Так, протеолітичні ферменти розщеплюють білкові речовини до амінокислот.

Уреаза розкладає сечовину до СО2 та NH3. Аміак, що утворюється, і амонійні солі служать джерелом азотного живлення рослин і мікроорганізмів.

Інвертаза та амілаза беруть участь у розщепленні вуглеводів. Ферменти групи фосфатів розкладають фосфорорганічні сполуки ґрунту та відіграють важливу роль у фосфатному режимі останньої.

Для характеристики загальної ферментативної активності ґрунту зазвичай використовують найбільш поширені ферменти, властиві переважній більшості ґрунтової мікрофлори – інвертазу, каталазу, протеазу та інші.

У разі нашої республіки проводилося чимало досліджень 16, з. 115 з вивчення зміни рівня родючості та ферментативної активності ґрунтів при антропогенний вплив, однак отримані дані не дають вичерпну відповідь на характер змін через складність зіставлення результатів через відмінність умов проведення дослідів та методик досліджень.

У зв'язку з цим пошук оптимального рішенняпроблеми поліпшення гумусного стану ґрунту та його ферментативної активності в конкретних ґрунтово-кліматичних умовах на основі розробки ресурсозберігаючих прийомів основної обробки ґрунту. мінімальних витратах, Дуже актуальний.

Ферменти – це каталізатори хімічних реакцій білкової природи, що відрізняються специфічністю дії щодо каталізу певних хімічних реакцій. Вони є продуктами біосинтезу всіх живих ґрунтових організмів: деревних та трав'янистих рослин, мохів, лишайників, водоростей, мікроорганізмів, найпростіших, комах, безхребетних та хребетних тварин, представлених у природній обстановці певними сукупностями – біоценозами.

Біосинтез ферментів у живих організмах здійснюється завдяки генетичним факторам, відповідальним за спадкову передачу типу обміну речовин та його пристосувальну мінливість. Ферменти є робочим апаратом, з якого реалізується дію генів. Вони каталізують в організмах тисячі хімічних реакцій, у тому числі складається клітинний обмін. Завдяки їм хімічні реакції в організмі здійснюються з швидкістю.

Нині відомо понад 900 ферментів. Їх поділяють на шість основних класів.

1. Оксиредуктази, що каталізують окисно-відновні реакції.

2. Трансферази, що каталізують реакції міжмолекулярного перенесення різних хімічних груп та залишків.

3. Гідролази, що каталізують реакції гідролітичного розщеплення внутрішньомолекулярних зв'язків.

4. Ліази, що каталізують реакції приєднання груп з подвійних зв'язків та зворотні реакції відриву таких груп.

5. Ізомерази, що каталізують реакції ізомеризації.

6. Лігази, що каталізують хімічні реакції з утворенням зв'язків за рахунок АТФ (аденозинтрифосфорної кислоти).

При відмиранні та перегниванні живих організмів частина їх ферментів руйнується, а частина, потрапляючи у ґрунт, зберігає свою активність і каталізує багато ґрунтових хімічних реакцій, беручи участь у процесах ґрунтоутворення та у формуванні якісної ознаки ґрунтів – родючості. У різних типахґрунтів під певними біоценозами сформувалися свої ферментативні комплекси, що відрізняються активністю біокаталітичних реакцій.

В. Ф. Купревич і Т. А. Щербакова (1966) відзначають, що важливою рисою ферментативних комплексів ґрунтів є впорядкованість дії наявних груп ферментів, яка проявляється в тому, що забезпечується одночасна дія ряду ферментів, що представляють різні групи; виключаються утворення та накопичення сполук, що є у ґрунті в надлишку; надлишки накопичених рухомих простих з'єднань(наприклад, NH 3) тим чи іншим шляхом тимчасово зв'язуються і направляються в цикли, що завершуються утворенням більш менш складних сполук. Ферментативні комплекси є врівноваженими саморегулюючими системами. У цьому основну роль відіграють мікроорганізми та рослини, що постійно поповнюють ґрунтові ферменти, оскільки багато з них є короткоживучими. Про кількість ферментів побічно судять з їхньої активності у часі, що залежить від хімічної природи речовин, що реагують (субстрату, ферменту) та від умов взаємодії (концентрації компонентів, рН, температури, складу середовища, дії активаторів, інгібіторів тощо).

У цьому розділі розглядається участь у деяких хімічних ґрунтових процесах ферментів з класу гідролаз - активність інвертази, уреази, фосфатази, протеази та з класу оксиредуктаз - активність каталази, пероксидази та поліфенолоксидази, що мають велике значенняу перетворенні азот- і фосфоровмісних органічних речовин, речовин вуглеводного характеру та у процесах утворення гумусу. Активність цих ферментів – суттєвий показник родючості ґрунтів. Крім того, буде охарактеризовано активність цих ферментів у лісових та орних ґрунтах різного ступеня окультуреності на прикладі дерново-підзолистих, сірих лісових та дерново-карбонатних ґрунтів.

ХАРАКТЕРИСТИКА ГРУШЕНИХ ФЕРМЕНТІВ

Інвертаза – каталізує реакції гідролітичного розщеплення сахарози на еквімолярні кількості глюкози та фруктози, впливає також на інші вуглеводи з утворенням молекул фруктози – енергетичного продукту для життєдіяльності мікроорганізмів, каталізує фруктозотрансферазні реакції. Дослідження багатьох авторів показали, що активність інвертази краще за інші ферменти відображає рівень родючості та біологічної активності ґрунтів.

Уреаза-каталізує реакції гідролітичного розщеплення сечовини на аміак та діоксид вуглецю. У зв'язку з використанням сечовини в агрономічній практиці необхідно мати на увазі, що активність уреази вище у більш родючих ґрунтів. Вона підвищується у всіх ґрунтах у періоди їх найбільшої біологічної активності – у липні – серпні.

Фосфатаза (лужна та кисла) - каталізує гідроліз низки фосфорорганічних сполук з утворенням ортофосфату. Активність фосфатази знаходиться у зворотній залежності від забезпеченості рослин рухомим фосфором, тому вона може бути використана як додатковий показник при встановленні потреби внесення до ґрунту фосфорних добрив. Найбільш висока фосфатазна активність у ризосфері рослин.

Протеази - це група ферментів, за участю яких білки розщеплюються до поліпептидів та амінокислот, далі вони піддаються гідролізу до аміаку, діоксиду вуглецю та води. У зв'язку з цим протеази мають найважливіше значення у житті грунту, оскільки із нею пов'язані зміна складу органічних компонентів і динаміка засвоюваних рослин азоту.

Каталаза – в результаті її активуючої дії відбувається розщеплення перекису водню, токсичного для живих організмів, на воду та вільний кисень. Великий впливна каталазну активність мінеральних ґрунтів надає рослинність. Як правило, грунти, що знаходяться під рослинами з потужною кореневою системою, що глибоко проникає, характеризуються високою каталазною активністю. Особливість активності каталази полягає в тому, що вниз по профілю вона мало змінюється, має зворотну залежність від вологості ґрунтів та пряму – від температури.

Поліфенолоксидаза та пероксидаза - їм у ґрунтах належить важлива рольу процесах гумусоутворення. Поліфенолоксидаза каталізує окислення поліфенолів у хінони у присутності вільного кисню повітря. Пероксидаза каталізує окислення поліфенолів у присутності перекису водню або органічних перекисів. При цьому її роль полягає в активуванні перекисів, оскільки вони мають слабку окислювальну дію на феноли. Далі може відбуватися конденсація хінонів з амінокислотами та пептидами з утворенням первинної молекули гумінової кислоти, яка надалі здатна ускладнюватися за рахунок повторних конденсацій (Кононова, 1963).

Помічено (Чундерова, 1970), що відношення активності поліфенолоксидази (S) до активності пероксидази (D), виражене у відсотках (), має зв'язок із накопиченням у ґрунтах гумусу, тому ця величина отримала назву умовний коефіцієнт накопичення гумусу (К). У орних слабоокультурених ґрунтів Удмуртії за період з травня по вересень він становив: у дерново-підзолистого – 24 %, у сірого лісового опідзоленого – 26 і у дерново-карбонатного ґрунту – 29 %.

ФЕРМЕНТАТИВНІ ПРОЦЕСИ У ҐРУНТАХ

Біокаталітична активність ґрунтів знаходиться у значній відповідності зі ступенем збагаченості їх мікроорганізмами (табл. 11), залежить від типу ґрунтів та змінюється за генетичними горизонтами, що пов'язано з особливостями зміни вмісту гумусу, реакції, Red-Ox-потенціалу та інших показників за профілем.

У цілинних лісових грунтах інтенсивність ферментативних реакцій переважно визначають горизонти лісової підстилки, а орних - орні верстви. Як в одних, так і в інших ґрунтах всі біологічно менш активні генетичні горизонти, що знаходяться під горизонтами А або А п, мають низьку активність ферментів, що незначно змінюється в позитивний бікпри окультуренні ґрунтів. Після освоєння лісових ґрунтів під ріллю ферментативна активність утвореного орного горизонту в порівнянні з лісовою підстилкою виявляється різко зниженою, але в міру його окультурення підвищується і в сильно окультурених видах наближається або перевищує показники лісової підстилки.

11. Зіставлення біогенносгу та ферментативної активності ґрунтів Середнього Передуралля (Пухідська, Ковриго, 1974)

№ розрізу, назва ґрунту	Горизонт, глибина взяття зразка, см		Загальна кількість мікроорганізмів, тис. на 1 г абс. сухий. ґрунту (в середньому за 1962, 1964-1965 рр.)	Показники активності ферментів (загалом за 1969-1971 рр.)
				Інвертаза, мг глюкози на 1 г ґрунту за I добу	Фосфатаза, мг фенолфталеїну на 100 г ґрунту за 1 год	Уреаза, мг NH, на 1 г ґрунту за 1 добу	Каталаза, мл 0 2 на 1 г ґрунту за 1 хв	Поліфенолоксидаза		Пероксидаза
								мг пурпурогалліну на 100 г ґрунту
3. Дерново-середньопідзолиста середньосуглиниста (під лісом)
					Не визначали
1.Дерново-середньо-підзолиста середньо-суглиниста слабоокультурена
10. Сіраялісна опідзолена важко осуглиниста слабоокультурена
2. Дерново-карбонатна слабовищело-чена л егкосуглиниста слабоокультурена

Активність біокаталітичних реакцій ґрунтів змінюється. Найменша вона навесні та восени, а найвища зазвичай у липні-серпні, що відповідає динаміці загального ходу біологічних процесіву ґрунтах. Однак залежно від типу ґрунтів та їх географічне положеннядинаміка ферментативних процесів дуже різна.

Контрольні питання та завдання

1. Які сполуки називають ферментами? Які їх продукування та значення для живих організмів? 2. Назвіть джерела ґрунтових ферментів. Яку роль грають окремі ферменти у ґрунтових хімічних процесах? 3. Дайте поняття про ферментативний комплекс грунтів та його функціонування. 4. Дайте загальну характеристикутечії ферментативних процесів у цілинних та орних ґрунтах.

Поняття про ферменти

Ферментами (ензимами)називають розчинні чи пов'язані з мембранами білки, наділені каталітичної активністю. (Крім білків каталітичну активність в організмі можуть проявляти деякі РНК (рибозими) і антитіла (абзими), проте вони в тисячі разів менш ефективні, ніж ферменти. . Вони нагадують перші джерела ферментів. Біохімії, яка вивчає ферменти, називається ензимологія. На схемах і рівняннях реакцій молекули ферментів позначають - Е. Речовини, перетворення яких каталізують ферменти, називають субстратами (S). Продуктиензиматичної реакції позначають - Р. Оскільки ферменти є білками, їх одержують у гомогенному вигляді тими самими способами, що й інші білки. Для ферментів характерні фізико-хімічні властивості, властиві білкам.

Відмінність ферментів від неорганічних каталізаторів:

а) прискорюють реакції значно ефективніше;

б) наділені високою специфічністю дії;

в) піддаються регуляції у фізіологічних умовах;

г) діють у м'яких умовах.

Будова ферментів

Ферментами можуть бути як прості, так і складні (кон'юговані) білки, до складу яких можуть входити ліпіди, вуглеводи, іони металів, азотисті основи, похідні вітамінів. В організмі ферменти можуть функціонувати як у розчинному стані, так і у вигляді нерозчинних комплексів або входити до складу біологічних мембран.

Відмінною рисоюферментів є наявність активного центру. Активний центр -це унікальна комбінація зближених у просторі амінокислотних залишків, яка забезпечує:

а) впізнавання молекули субстрату,

б) зв'язування субстрату з ферментом,

в) здійснення каталітичного перетворення (у разі складного ферменту в акті каталізу також бере участь кофермент, що входить до складу активного центру).

Активний центр виникає тоді, коли білок згортається і приймає свою нативну (активну) конформацію. Структура активного центру може бути змінена при взаємодії з субстратом. За образним виразом Д. Кошланд субстрат підходить до активного центру як рука до рукавички.

Одна молекула ферменту, особливо якщо вона складається з кількох субодиниць, може містити більше активного центру.

В активному центрі є дві ділянки. Перша ділянка відповідає за впізнавання та зв'язування субстрату. Він називається субстрат-зв'язуючим ділянкою або якірним майданчиком. Друга ділянка називається каталітичною, до її складу входять амінокислотні залишки, що беруть участь в акті каталізу.

Ферменти представляють білки, що сильно розрізняються за молекулярною масою та складністю будови. Прикладом ферменту з невеликою молекулою є рибонуклеаза, що складається з однієї субодиниці з молекулярною масою 13700 Да. (У рибонуклеази визначена амінокислотна послідовність. У 1969 р. рибонуклеаза була синтезована в лабораторії Б. Мерріфілда в Нью-Йорку.) Багато ферментів складаються з декількох субодиниць, наприклад, лактатдегідрогеназа складається з чотирьох субодиниць двох видів. На цей час відомо кілька мультиферментних комплексів, які з десятків різних субодиниць і кілька типів коферментів. Наприклад, піруватдегідрогеназний комплекс складається з 60 субодиниць трьох типів та п'яти типів кофакторів. Молекулярна маса такого комплексу становить 2,3 * 10 6 - 10 * 10 6 Так залежно від джерела ферменту. Молекула ферменту може бути меншою, ніж молекула субстрату. Наприклад: молекули ферментів амілази та рибонуклеази менші, ніж молекули їх субстратів – крохмалю та РНК.

Білкова частина складних ферментів каталітично неактивна і називається апоферментом. Зв'язування апоферменту з небілковим компонентом призводить до утворення каталітично активного ферменту (холоферменту):

Багато ферментів містять у своєму складі іон металу, який може виконувати різні функції:

а) брати участь у зв'язуванні субстрату та процесі його каталітичного перетворення;

б) сприяти приєднанню коферменту до молекули ферменту;

в) стабілізувати третинну структуру ферменту (наприклад, Са 2+ в амілазі);

г) зв'язуючись із субстратом, утворювати справжній субстрат, на який діє фермент.

Багато коферментів є похідними вітамінів, тому порушення обміну речовин при вітамінній недостатності обумовлено зниженням активності певних ферментів.

Деякі ферменти поряд з активним центром містять алостеричний (регуляторний) центр -ділянка білкової глобули, поза активним центром, де можуть зв'язуватися речовини, що регулюють ферментативну активність. Ці речовини називають алостеричними ефекторами (алостеричними активаторами або інгібіторами). Внаслідок зв'язування ефектора з алостеричним центром відбувається зміна структури білка, що призводить до зміни просторового розташування амінокислотних залишків в активному центрі і, в результаті, зміни ферментативної активності.

Ферменти, що зустрічаються в одному організмі та каталізують одну й ту саму хімічну реакцію, але з різною первинною структурою білка, називаються ізоферментами. Ізоферменти відрізняються один від одного за такими фізико-хімічним властивостям, як молекулярна маса, термостабільність, субстратна специфічність, електрофоретична рухливість Природа появи ізоферментів різноманітна, але найчастіше зумовлена ​​відмінностями у структурі генів, що кодують ці ізоферменти або їх субодиниці. Наприклад, фермент лактатдегідрогеназа (ЛДГ), що каталізує оборотну реакціюокислення лактату до пірувату, має чотири субодиниці двох типів М та Н, комбінація цих субодиниць лежить в основі формування п'яти ізоферментів ЛДГ (рис.1). Для діагностики захворювань серця та печінки необхідне дослідження ізоферментного спектру ЛДГ у сироватці крові, оскільки ЛДГ 1 та ЛДГ 2 активні у серцевому м'язі та нирках, а ЛДГ 4 та ЛДГ 5 - а скелетних м'язахта печінки.

Рис.1 Будова різних ізоферментів ЛДГ.

Вимірювання ферментативної активності

Визначення активності ферментів здійснюється шляхом вимірювання швидкості реакцій, що каталізуються. Швидкість ферментативних реакцій вимірюють за зменшенням концентрації субстрату або збільшення концентрації продукту за одиницю часу:

v = -ΔС S /Δτ , v = ΔC P /Δτ ,

де ΔС S- Зміна молярної концентрації субстрату (моль / л),

ΔC P- Зміна молярної концентрації продукту реакції (моль/л),

Δτ – зміна часу (хв, сек).

Кінетичні дослідження бажано проводити при насичувальній концентрації субстрату, в іншому випадку фермент не матиме змоги проявити максимальну активність.

Одиниці активності ферментів:

Міжнародна одиниця ферменту (U)- це така кількість ферменту, що каталізує перетворення 1 мкмоль субстрату за 1 хвилину при температурі 25 про С та оптимальному рН середовища.

У системі СІ одиницею ферменту є катал (кат)-Це така кількість ферменту, яке каталізує перетворення одного мольсубстрату за 1 секунду. Неважко підрахувати, що:

1 U = (1 * 10 -6 М) / 60 с = 1,67 * 10 -8 М с-1 = 1, 67 * 10 -8 кат = 16,7 нкат.

Часто визначають питому активністьпрепаратів ферменту розподілом активності навішування препарату ферменту, вираженої в (U), на масу навішування в міліграмах:

А уд = U/маса препарату (мг)

При очищенні ферментів питома активність зростає. За зростанням питомої активності можна судити про ефективність стадій очищення та чистоту ферментного препарату.

Для оцінки активності високоочищених, гомогенних препаратів ферментів розподілом числа міжнародних одиниць (U) ферменту у зразку на кількість речовини ферменту (мкмоль) у цьому зразку розраховують молярну активність(число обертів). За фізичним змістом молярна активність - це число молекул субстрату, що піддаються перетворенню однією молекулі ферменту за 1 хвилину чи 1секунду. Наприклад: для уреази, що прискорює гідроліз сечовини, молярна активність становить 30000, трипсину – 102, глюкозоксидази – 17000 циклів на секунду.

Властивості ферментів

4.1. Механізм дії.Ферменти не зміщують рівновагу реакцій, що каталізуються, у бік утворення продуктів, таким чином, константа рівноваги реакції залишається постійною. Як і всі каталізатори, ферменти лише зменшують час досягнення цієї рівноваги. Найчастіше ферменти прискорюють реакції в 10 7 - 10 14 разів. В основі ефективності ферментативного каталізулежить сильне зниження енергії активації реакції за рахунок перетворення субстрату на продукт через перехідні стани.

4.2. Специфіка дії. Специфічність зв'язування з субстратом та шляхи протікання ферментативної реакції визначаються апоферментом. Специфіка дії ферментів визначає спрямований обмін речовин в організмі.

Про ферменти говорять, що вони мають вузьку субстратну специфічністьякщо вони діють на дуже невелике коло субстратів. Іноді можна говорити про абсолютної субстратної специфічності,наприклад, каталаза каталізує лише одну реакцію - розкладання пероксиду водню:

Для більшості ферментів характерна відносна (широка, групова) субстратна специфічністьколи вони каталізують групу однотипних реакцій. Наприклад, алкогольдегідрогеназа каталізує перетворення спиртів на альдегіди, причому як субстрати можуть виступати метанол, етанол, пропанол та інші спирти. Цікавим є той факт, що алкогольдегідрогеназа може окислювати і нелінійні спирти, а також спиртову групу, що входить до складу складних молекул, зокрема, цей фермент може каталізувати перетворення ретинолу на ретиналь. Звичайно, ферменти, наділені широкою субстратною специфічністю, каталізують перетворення субстратів з різною ефективністю.

Ферменти наділені також стереохімічною специфічністю: їх активний центр розпізнає молекули субстратів щодо просторової конфігурації. Наприклад, оксидази L-амінокислот активні лише щодо L-амінокислот і зовсім не діють на їх D-аналоги. Для окисного дезамінування D-амінокислот у живих організмах є оксидази D-амінокислот, що не діють на L-амінокислоти. Саме здатність активного центру зв'язуватися з певними стереоізомерами субстрату є основою функціонування таких ферментів, як рацемази, які перетворюють одні стереоізомери на інші.

Специфіка шляхів перетворенняполягає в тому, що один субстрат під дією різних ферментів може перетворюватися на продукти, що розрізняються за структурою та роллю в метаболізмі.

Наведемо приклад: оксидази L-амінокислотдіють на L-амінокислоти, перетворюючи їх на альфа-кетокислоти з утворенням аміаку та пероксиду водню.

Декарбоксилази L-амінокислотзв'язуються з тими ж субстратами, але каталізують іншу реакцію: декарбоксилювання з утворенням біогенних амінів та виділенням вуглекислого газу.

Ще одним прикладом є можливість перетворення глюкозо-6 фосфату під дією різних ферментів, по одному з можливих метаболічних шляхів:

4.3. Термолабільність .

Як і багато білків, при підвищенні температури ферменти піддаються термічній денатурації, що призводить до порушення нативної конформації ферменту та зміни структури активного центру. Ферменти ссавців починають помітно денатурувати за температур вище 40 про З.

У зв'язку з вищесказаним ферментні препарати бажано зберігати при знижених температурах. Одним з кращих шляхів збереження ферментів є їх ліофілізація (висушування при температурі нижче -70 про С у вакуумі), переведення в частково денатурований стан за допомогою амонію солей і приміщення в холодильник.

4.4. Залежність швидкості реакції від температури.Швидкість ферментативних реакцій, як будь-яких хімічних реакцій, залежить від температури. При підвищенні температури на 10 про З швидкість реакції збільшується в 2-4 рази згідно з правилом Вант-Гоффа. Однак при температурах вище 40 о С істотною стає денатурація ферментів, що призводить до зменшення сумарної активності (рис. 2):

Мал. 2. Залежність швидкості ферментативної реакції від температури.

4.5. Залежність швидкості реакції від рН.Залежність швидкості ферментативної реакції від рН має дзвоноподібний вигляд (рис. 3). Значення рН, у яких спостерігається найвища швидкість ферментативної реакції, називають оптимальними (рН-оптимум). Характер кривих та значення рН-оптимуму залежить від природи заряджених груп субстрату та заряджених груп ферменту (особливо тих, що входять до активного центру). Оптимум рН більшість ферментів лежить у межах від 6,0 до 8,0 (рис. 3).

Мал. 3. Залежність швидкості ферментативної реакції від рН.

Однак є і винятки, наприклад, пепсин найбільш активний при рН 1,5 - 2,0, а лужна фосфатаза при рН 10,0 - 10,5 (рис. 4)

Мал. 4. Залежність швидкості ферментативної реакції (v) від рН середовища.

При екстремальних (дуже низьких або дуже високих) значеннях рН відбувається порушення третинної структуримолекули ферменту, що веде до втрати ферментативної активності.

Подібна інформація.